Genetik hastalıklar, bireylerin biyolojik işlevlerini, metabolik süreçlerini veya belirli temel proteinlerin üretimini etkileyen genlerdeki mutasyonlardan ve çeşitli kalıtsal bozukluklardan kaynaklandığından hala küresel bir sorundur. Gen terapisi ilaçları, belirli genleri hedef alan, onları onarmayı veya değiştirmeyi amaçlayan ve hücrelere fonksiyonel proteinler üretmeleri için yeni talimatlar sağlayan veya hastalıklara neden olan gen kusurlarına müdahale eden bir tür terapötik müdahaledir.
Yaygın gen ilaçları temel olarak DNA ve RNA'yı içerir; burada DNA, terapötik etkileri olan gen fragmanları veya gen dizileri olabilir. Bu DNA, kusurlu veya eksik gen fonksiyonlarını değiştirmek veya tamamlamak için hücrelere iletilir. RNA, haberci RNA (mRNA), küçük müdahaleci RNA (siRNA) veya antisens oligonükleotidler (ASO) vb. olabilir; bunlar, zararlı genlerin ifadesini değiştirmek, inhibe etmek veya belirli genlerin işlevini eski haline getirmek için kullanılabilir.
Ancak hem DNA hem de RNA, insan vücuduna girmekten hedef hücrelere ulaşmaya kadar birçok zorlukla karşı karşıyadır. Gastrointestinal sistemde gen dizileri kararsız olduğundan genellikle damar içi veya deri altı enjeksiyon yoluyla uygulanırlar, ancak yine de gen dizilerinin çoğu insan vücudunda bol miktarda bulunan nükleazlar tarafından parçalanır.
Az miktarda artık gen ilacı hedef hücrelerin dışına ulaştığında hücrelere giremezler çünkü gen dizileri negatif yük taşıyan fosfat gruplarına sahip büyük moleküllerdir, hücre zarları da negatif yük taşır. İki negatif yük karşılaştığında genler itilir ve hücrelere giremez. Bu nedenle, bunların in vivo bozulmasını önlemek, hücre zarına nüfuz etme verimliliğini artırmak ve DNA veya RNA dizilerini hücrelere sorunsuz bir şekilde iletmek için spesifik gen ilaç dağıtım yöntemleri geliştirmemiz gerekiyor.
Gen İlaçlarının Dağıtım Yöntemleri
Mevcut yaygın gen dağıtım yöntemleri temel olarak iki kategoriye ayrılır: viral vektör dağıtımı ve-viral olmayan vektör dağıtımı. Viral vektör dağıtımı esas olarak adeno-ilişkili virüs (AAV) ve lentivirüs vb. içerir; bunlar, konakçı hücrelerin virüs enfeksiyonu sürecini simüle edebilir ve hücre bariyerlerini kolayca geçebilir, böylece yüksek dağıtım verimliliği elde edilebilir. Bununla birlikte, viral vektör dağıtımının da sorunları vardır: Birincisi, sınırlı paketleme kapasitesine sahiptir, örneğin AAV'nin maksimum paketleme kapasitesi 4,7 kb'dir ve daha uzun gen dizileri sağlayamaz; ikinci olarak viral vektörler, hücresel bağışıklık ve humoral bağışıklık da dahil olmak üzere ciddi bağışıklık reaksiyonlarına neden olabilir ve klinik uygulamalar için risk oluşturabilir. Bununla karşılaştırıldığında,-viral olmayan vektörlerin güvenlik ve ilaç yükleme kapasitesi açısından çok büyük avantajları vardır.
Şu anda yaygın olarak kullanılan-viral olmayan vektörler temel olarak lipozomları, polimerleri, nanopartikülleri, eksozomları vb. içerir; bunların arasında lipozomlar, çapları 100 nm ila 1 um arasında değişen amfifilik moleküller tarafından oluşturulan keseciklerdir. Esas olarak fosfolipitler, kolesterol, PEG lipitleri ve katyonik lipitlerden oluşurlar. Fosfolipid çift katmanlı yapısı hücre zarlarına benzer ve endositoz yoluyla hücrelere sorunsuz bir şekilde girebilir. Ek olarak lipozomlar, belirli dokuları veya hücreleri hedef alırken vücudun bağışıklık temizliğinden kaçmak için yüzeylerindeki PEG'i veya spesifik antikorları da değiştirebilir. Katyonik lipozomlar, negatif yüklü nükleik asit ilaçlarıyla daha iyi bağlanabilen ve dağıtım sisteminin stabilitesini koruyabilen pozitif yüklü kuaterner amonyum tuzu lipitleri içeren lipozomlardır. Bu nedenle lipozomlar, gen ilaçları için yaygın olarak kullanılan-viral olmayan vektör dağıtım yöntemlerinden biridir.
Bununla birlikte, geleneksel lipozomların da bazı sorunları vardır: her şeyden önce, lipozom çaplarının geniş aralığı nedeniyle, her ne kadar bu yeterli ilaç yükleme kapasitesi sağlasa da, lipozomlar vasküler endotelyal boşluktan (100-200nm) geçtiğinde, çok büyük boyut bu süreci engelleyecektir. Ek olarak, lipozomlar endositoz yoluyla hücrelere girip endozom-lizozom sistemini oluşturduktan sonra, geleneksel lipozomlar lizozomal kaçışı zamanında tamamlayamaz, bu da çoğu gen ilacının lizozomlar tarafından parçalanmasına ve etkilerini gösterememesine neden olur. Geleneksel lipozomların gen ilaçlarının dağıtımındaki bu eksikliklerine dayanarak, lipit nanopartikülleri (LNP) geliştirildi ve özellikle nükleik asitlerin hedef hücre ve dokulara taşınması için uygun olan önemli bir dağıtım yöntemi haline geldi.
LNP Taşıyıcı Sisteme Giriş
Lipid nanopartikülleri (LNP), lipit-benzeri maddelerden oluşan ve genellikle 10-200nm arasında bir çapa sahip nanopartiküllerdir. Geleneksel lipozomlarla karşılaştırıldığında daha küçüktürler ve vasküler endotelyal boşluklardan geçmeleri daha kolaydır. Ayrıca LNP genellikle katyonik/iyonlaşabilen lipitler, yardımcı fosfolipitler, polietilen glikol (PEG) lipitleri ve kolesterolden oluşur. Bunlar arasında yardımcı fosfolipitler ve kolesterol, LNP'nin stabilitesini artırabilir; PEG lipitleri, LNP'nin in vivo dolaşım süresinin artmasına ve bağışıklık reaksiyonlarının azaltılmasına yardımcı olur. Bu bileşenler geleneksel lipozomlarla benzer işlevlere sahiptir. Aradaki fark, aynı zamanda LNP'nin patent korumasının da ana alanı olan katyonik/iyonize lipitlerde yatmaktadır.
Daha önce bahsedildiği gibi katyonik lipozomlar, nükleik asit ilaçlarıyla bağlanmayı etkili bir şekilde koruyabilir ve nükleik asit ilaçlarının dağıtım etkinliğini geliştirebilir. Bununla birlikte, katyonik lipozomlar aynı zamanda vücut dolaşımındaki negatif yüklü plazma proteinleri, kan hücreleri vb. ile spesifik olmayan- bağlanmaya da yatkındır, bu da lipozom toplanmasına neden olur ve hızla vücuttan atılır (katyonik lipozomların in vivo yarı ömrü yalnızca 15 dakikadır).
Bu sorunu çözmek için araştırmacılar, iyonlaşabilen lipitler adı verilen yeni bir tür lipit materyali geliştirdiler. İyonlaşabilen lipitler yapı olarak katyonik lipitlere çok benzer. Ortak katyonik lipit DOTAP ve iyonlaşabilir lipit DODAP'ı örnek olarak alırsak, fark, DOTAP'ın pozitif yüklü bir dördüncül amonyum tuzu olması, DODAP'ın ise üçüncül bir amin yapısı olmasıdır. Tersiyer amin yapısı lipidin pKa'sını 6-7 arasında tutabilmektedir. PH, pKa'dan düşük olduğunda (asidik koşullar altında), iyonlaşabilen lipitler pozitif olarak yüklenir.
PH pKa'ya yakın olduğunda (nötr koşullar altında), iyonlaşabilen lipitler nötrdür. Bu tasarım, katyonik lipozomların karşılaştığı sorunu akıllıca çözebilir: Kan dolaşımındaki pH nötre yakın olduğundan, iyonlaşabilen lipitler de nötrdür ve bunlar ile plazma proteinleri veya kan hücreleri arasındaki-spesifik olmayan bağlanma önemli ölçüde azaltılarak yarı-ömrü uzatılır. Ayrıca iyonlaşabilen lipit LNP, hücreler tarafından alınıp lizozomlara girdiğinde, lipitler iyonize olur ve lizozomal ortamda pH 5-6 ile pozitif olarak yüklenir. Pozitif yüklü lipitler, endozom-lizozom membranı ile kolaylıkla birleşerek, lipozomların sitoplazmaya kaçmasına, nükleik asitleri ayrıştırıp serbest bırakmasına ve böylece etkilerini göstermesine olanak tanır. Özetle, LNP taşıyıcı sisteminin tasarlanması, verimli gen iletimini sağlamak için lipit bileşiminin, parçacık boyutunun, yüzey yükünün ve stabilitenin optimize edilmesini içerir.
LNP-paketlenmiş Gen İlaçları için LCMS Biyoanaliz Stratejisi
LNP-paketlenmiş gen ilaçları esas olarak LNP kabuğundan ve gen ilacının kendisinden oluşur. LNP kabuğu temel olarak lipit bileşenlerinden oluşur (katyonik/iyonize lipitler yaklaşık %30-50'yi oluşturur, PEG lipitleri yaklaşık %2'yi oluşturur, kolesterol yaklaşık %20-50'yi oluşturur, yardımcı fosfolipitler yaklaşık %10-20'yi oluşturur), gen ilaçları ise esas olarak gen dizisi fragmanlarından (DNA, ASO, siRNA ve miRNA, vb.) oluşur. NMPA ve FDA'nın[14-15] son düzenlemelerine göre, LNP gibi ilaç taşıyıcı sistem ilaçlarının IND uygulaması için, etken madde (gen dizisi) üzerinde farmakolojik ve farmakokinetik çalışmaların yapılmasının yanı sıra, katyonik/iyonlaşabilir lipidler ve LNP'de özel modifikasyonlara sahip PEG lipidleri gibi ilaç taşıyıcı sistemde pazarlanan ilaçlarda kullanılmayan yeni lipid bileşenleri için de güvenlik ve farmasötik değerlendirme yapılması gerekmektedir.
LNP lipidlerinin LCMS biyoanalizi katyonik/iyonlaşabilen lipidlere ve PEG lipidlerine odaklanır. Aralarındaki yapısal farklılıklar nedeniyle, katyonik/iyonlaşabilen lipit molekül ağırlığı genellikle 1 kDa dahilindeyken PEG lipit molekül ağırlığı, modifikasyon gruplarını taşıdıktan sonra 2~5 kDa'ya ulaşabilir, bu da aralarında kromatografik tutma ve kütle spektrometresi tepkisinde büyük farklılıklara neden olur. LNP'deki katyonik/iyonlaşabilen lipit içeriğinin PEG lipitinden daha yüksek olduğu göz önüne alındığında, tepki farkı her ikisinin de ön arıtma yöntemlerinin (ekstraksiyon solventinin seçimi, seyreltme faktörünün belirlenmesi) etkin bir şekilde birleştirilememesi sonucunu doğurmaktadır. Buna ek olarak, PEG lipidinin tepe konumu etrafında birçok engelleyici tepe noktasının varlığı nedeniyle, etkili ayırma için genellikle daha uzun bir sıvı faz ayırma gradyanı gerekir ve bu, yüksek analiz verimliliğini garanti edemez. Bu nedenle biyoanalizde PEG lipid tespit yöntemini ayrı ayrı kuruyoruz. Aynı zamanda katyonik/iyonlaşabilen lipit ve PEG lipit, sudaki zayıf çözünürlük, biyolojik matriksteki kararsızlık, proteinin geri kazanıma bağlanma limitini aşması, PEG lipitinin yüksek etkileşimi ve kalıntısı, gerçek numune matriksindeki lipitin stabilite değişimi ve dahili standart seçiminde zorluk gibi lipit bileşenlerinden dolayı yöntem geliştirmede ortak zorluklara sahiptir.
